组织标本经甲醛固定24-48h，常规脱水、透明、浸蜡和包埋；4μm石蜡切片，贴在涂有APES胶的干净载玻片上。58℃烤8-24h。ISH试剂的配制（所有试剂和用具均用DEPC水处理）。

二、操作流程： 

一、杂交片的前处理

1、常规脱蜡至水。

2、0.01mol/L,pH8.0 EDTA(用0.02 mol/L,pH8.0TB配制)  98℃ 煮 15min;

3、自然冷却 15min,蒸馏水洗2-5min;

4、2μg/ml蛋白酶K(用TE配制) 室温 4min, 0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min.；

5、蒸馏水洗2-5min;

6、75%,85%,95%,100%酒精系列脱水各1min；

二、杂交

将荧光标记探针加入48ul无RNAas PBS溶解，用杂交液（4×SSC,25%去离子甲酰胺, 无RNAas PBS）1:200稀释,20ul杂交液并覆盖，55℃杂交90min, 37℃杂交：24h，

三、杂交后洗涤（洗涤过程应避光）

(1)将切片浸入杂交后洗涤缓冲液的洗缸中72℃ 30min（洗缸应提前30min放入72℃水浴锅内预热到72℃，2×10min。

★杂交后洗涤缓冲液：2×SSC/0.3% NP-40

20×SSC pH5.3            100ml

蒸馏水                        847ml

NP40                           3ml

最后体积                     1000ml

用1N NaOH调pH7.0-7.5。

(2)2×SSC.0.3% NP-4073℃洗3min。

⑶0.4×SSC.0.3% NP-4073℃洗3min

⑷70%乙醇洗 1min

(3)每片滴加10μl  DAP1(4,6 diamidino-2-phenylinodole)封片衬染5min。

(4)不及时观察，可将切片保存在-20℃冰箱暗处，观察时复温至室温即可。